在可再生资源中，脂肪酸及其衍生物的应用受到学术界和工业界研究人员慢慢的变多的关注。其中，十二烷二酸（DDA）作为重要成分，在塑料、纤维和润滑油等领域有广泛应用，具备极其重大合成价值。传统合成工艺有许多缺陷，包括高温度高压力、强酸和有毒试剂的使用等，存在安全和对环境造成污染等问题，如丁二烯法，产率低且对环境造成污染；发酵法，生产受限于提取和纯化效率。因此，现阶段需要开发更安全、环保且高效的合成工艺。

  近期，华东理工大学教授许建和、副教授张志钧团队基于植物中的脂氧合酶途径，设计并构建了用于从亚油酸生产 DDA 的多酶级联。经过优化限速步骤的反应条件后，以可再生亚油酸为原料，通过全细胞一锅法合成 DDA，产量高达 43.8 g/L/d。通过反应体系工程化和组分酶的共表达，在大肠杆菌中建立了一条可持续且环境友好的 DDA 生物合成路线，其产率在目前 DDA 生物合成研究进展中位居第二。目前，这项研究成果已经以“Whole-cell one-pot biosynthesis of dodecanedioic acid from renewable linoleic acid”为题发表在Bioresources and Bioprocessing上。

  首先，研究员设计了以亚油酸（LA）为底物的多酶级联反应。基于植物中脂氧合酶代谢途径，生产绿叶挥发物 （GLV），通过 13-脂氧合酶（LOX）、13-氢过氧化物裂解酶（HPL）、乙醛脱氢酶（ALDH）和大肠杆菌内源性双键还原酶等多酶作用，结合 NADH 氧化酶 (NOX)，从可再生亚油酸 (LA, a) 中实现 DDA 的高效生物合成。

  ▲图 从可再生亚油酸合成十二烷二酸的级联路线（来源：Bioresour Bioprocess）

  接下来，研究人员根据之前的研究，选择 Ri-LOX、Hv-HPL 和 Gt-ALDH 酶构建级联反应，将 LA（a）转化为二羧酸。由于不同酶的最佳 pH 值不同，所以选用偏好碱性的 Hv-HPL 和 Gt-ALDH 用于级联。然后通过 St-NOX 进行 NAD+ 再生，确保 NADH 快速氧化为 NAD+ (18.1 U/mg) ，并产生无害的水作为唯一的副产品，实现了级联酶的高效表达和转化。

  随后研究员通过 LOX/HPL/ALDH-NOX 级联实验，在 1 ml、pH 8.0、30℃ 条件下成功转化 LA 为二羧酸。但 MBP-HvHPL 催化效率较低，导致中间产物 b 积累，所以提高 MBP-HvHPL 的 C-C 键断裂效率，将是优化级联反应的关键一步。研究员们针对氢过氧化物裂解反应效率低的问题，优化了催化条件，发现一价阳离子如K+和洗涤剂去污剂 Triton X-100 可明显提高 MBP-HvHPL 的催化效率。KCl 最佳浓度为 2M，Triton X-100 最佳浓度为 0.08%（v/v），这些优化条件将有利于提升级联反应的整体效率。

  紧接着研究员们继续优化了 LOX-HPL 级联系统，发现 Ri-LOX 在 2M KCl 下活性最高，为 265 U/mg，但被 Triton X-100 灭活，不能采用。此外，在 LOX 的滞后期，LOX 和 HPL 竞争 13-HPOD (b) 。当反应混合物中 13-HPOD 累积至 4 μM 时，产物活化浓度（LOX）被完全激活。仅大于 0.004 U/mL 的 LOX 活性就足以将滞后期缩短至 1 分钟以内。因此，考虑到实际活性，Ri-LOX 的滞后期可忽略不计。优化后的 LOX-HPL 级联系统实现了 a 完全转化为c的可行性，摩尔产率达 98%。

  基于上述研究，作者通过构建了共表达四种酶的大肠杆菌系统(p-HRGS-2)，成功实现 LA 至 DDA 的全细胞高效转化。DDA 的全细胞一锅法合成在不同的 LA 负载量和细胞剂量下进行。当LA负载量增加至 100 mM 时，反应 12 h 后摩尔产率最高，为 92.9%，DDA 的 STY 为 43.8 g/L/d。

  总的来说，本研究通过优化脂氧合酶途径，建立了 DDA 的高效生物合成途径，利用可再生亚油酸实现全细胞一锅法合成 DDA，产量高达 43.8 g/L/d，是当前 LOX 途径衍生的多酶途径中最高的记录，也是当前 DDA 生物合成研究进展中的第二高记录。为 DDA 生物生产提供了一种新的可行途径，推动可再生亚油酸资源的利用，促进了可持续产业的发展。

  这篇论文通讯作者许建和教授是华东理工大学博士生导师，现任华东理工大学特聘教授、省部共建上海生物制造协同创新中心常务副主任；曾任生物反应器工程国家重点实验室主任(2006-2017)和生物工程学院副院长(2006-2015)。主要是做生化反应工程、酶分子工程及合成生物技术探讨研究，主持 1 项国家重点研发计划项目(2020-2024)，完成 1 项 973 计划课题、2 项 863 计划课题和 10 项国家自然科学基金项目(含 1 项重点基金)。公开发明专利 90 多项，授权 80 项，多项技术转让企业。

  张志钧，工学博士，副教授，硕士生导师。华东理工大学与美国明尼苏达大学联合培养博士。主要是做由廉价原料或可再生资源高效、绿色、低成本生物合成医药、农药、香料、材料以及食品添加剂等高的附加价值功能化学品的应用基础研究。主持国家自然科学基金、国家重点研发计划子课题、上海市自然科学基金和企业横向课题等科研项目 12 项。申请中国发明专利 13 项，授权 11 项。

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